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                成功案例
                基因敲除小鼠的繁育鑒定

                時間:2020-08-05 10:38:00 瀏覽:3729次



                1. Product Information

                Name

                C57BL/6-XXXtm1cyagen

                Serial Number

                KOCMP-21018-XXX

                Gene

                XXX

                NCBI ID

                18024

                Strain

                C57BL/6

                Type

                conventional knockout

                2. gRNA target sequence

                gRNA1 (matching forward strand ofgene): CAGCCCTTGGTTAGCAGCGCAGG

                gRNA2 (matching forward strand of gene): TTCTATACTAAACGTTAGCTAGG

                3. Delivery Information

                 4. Genotyping Strategy

                5. PCR Screening

                Animals 2 and 6 were identified positive by PCR screening.

                Note:

                1)PCR was carried out in 25 μL volume for 35 cycles under standard conditions, with primers listed above added to each reaction.


                 2) Taq DNA polymerase used was P112-01.



                 3) Two controls used in PCR genotyping are:


                 ? Water control: No DNA template added.


                 ? Wildtype control: 400 ng of mouse genomic DNA.  



                6. Sequencing Confirmation


                Sequencing Primer for PCR product:

                Sequence primer (F1): 5’-GAAGCATTATCATTTGGTGGGAAC-3’


                Sequencing Results:


                Positive animals

                Mouse ID: 2, 6 (Deleted 4961 bp and inserted 28 bp)

                7. Breeding and Genotyping strategy

                8. 配種與繁殖匯總

                小鼠配種與繁殖情況如下圖所示。

                1+/+DNA雙鏈都含有XXX基因,即野生型小鼠;+/-為只有一條DNA鏈含有XXX基因,即雜合子小鼠;-/-DNA雙鏈都不含XXX基因,即純合子小鼠。

                       (2)紅色字體標記表示純合子小鼠,藍色字體標記表示小鼠已死亡。

                      PCR鑒定

                     (1)5/9,2#,6#鑒定。

                     根據圖一,說明:2-1、6-1用引物F1/R1進行PCR;2-2、6-2用引物F1/R2進行PCR。鑒定結果:2#,6#為雜合子。

                      (2)5/19,7#~13#鑒定。

                       根據圖二,說明:前面是用引物F1/R1進行PCR;后面是用引物F1/R2進行PCR。鑒定結果:7#、9#、10#為純合子;11#、12#、13#為雜合子;8#為野生小鼠。其中11#引物F1/R1條帶不明顯,后續重新取材鑒定。

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